RNA干扰体外抑制HepG-2细胞bcl-2的表达

［摘要］目的：探索靶向bcl-2编码基因的shRNA表达载体抑制高表达的 bcl-2蛋白，诱导HepG-2细胞凋亡、抑制其生长的作用，以期为运用RNAi技术治疗肿瘤提供理论基础和实验依据。方法：采用DNA重组、RT-PCR、DNA序列测定、细胞凋亡与增殖检测等技术初步观察了靶向bcl-2编码基因的shRNA表达载体抑制bcl-2基因转录与翻译；诱导高表达bcl-2基因的HepG-2细胞凋亡及增殖受抑作用。结果：分析比较证实本文成功构建的3个靶向bcl-2的shRNA表达载体之一，即pGenesil-B2可有效抑制bcl-2表达（mRNA转录抑制率为49.1%）、并致细胞凋亡（细胞凋亡率为65.12%）和增殖抑制（抑制率为46.4%）。这些研究结果表明能有效抑制肿瘤细胞高表达的bcl-2基因的RNA干扰技术，有可能用于临床肿瘤治疗。

关键词：增强型绿色荧光蛋白 , B细胞白血病-2 ,短发夹RNA , RNA干扰，肝癌细胞系。

THE INHIBITING OF shRNA ON BCL-2 EXPRESSION IN HEPG-2 CELL

ABSTRACT

objective: to observe the inhibition of shRNA targeting bcl-2 gene on the expression of bcl-2 in HepG-2 cells. Methods: The(Three couple) DNA sequence targeting bcl-2 gene was cloned into the pGenesil-1, which is the vector expressing shRNA and enhance green fluorescent protein(EGFP) in mammalian cells, the recombinant vector was confirmed with restriction enzyme digestion、PCR and sequencing. Then RT-PCR was used to observe the recombinant vectors on inhibiting the genetic transcription and translation of bcl-2; The technique for detecting apoptosis and generation was used to observe the effects of the recombinant vectors inducing apoptosis and inhibiting generation for the HepG-2 cell expressing bcl-2 .Results: The recombinant vectors expressing shRNA were constructed successfully. Only one of the three vector expressing shRNA targeting bcl-2 could inhibit the HepG-2 expression of bcl-2(inhibition ratio of mRNA was 49.1%, induce the HepG-2 apoptosis ratio was 65.12% and inhibit HepG-2 generation ratio was 46.4%. So It is feasible to use RNAi to inhibit the replication of tumor cell and may be effective for the cancer therapy.

Key words: EGFP, bcl-2, shRNA, RNAi, HepG-2

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率呈上升趋势。如何有效治疗和控制肿瘤一直是医学领域、乃至生命科学领域急待解决的重大难题^[1]。bcl-2是一种细胞凋亡抑制基因，过度表达bcl-2的转基因小鼠可发生肿瘤^[2]； bcl-2基因易位、活化可见于多种B细胞淋巴瘤。这些研究结果提示bcl-2可能是一种能通过阻断细胞凋亡作用，而致肿瘤发生的重要分子，并且在肿瘤对化疗药物的反应性与抗药性中，bcl-2及其相关基因起着重要的调控作用^[3、4]。据此设想特异性封闭和阻断肿瘤细胞的bcl-2基因表达，有可能抑制肿瘤细胞增殖。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是通过内、外源性小型双链干扰RNA(short/small interference RNA， siRNA)靶向诱导mRNA水平上的基因沉默 ，特异性抑制细胞内同源基因表达和蛋白质合成的过程，是广泛存在于动植物中的一种基因沉默方式^[5、6]。siRNA在哺乳动物细胞中不仅可以诱导强有力的特异性 RNAi作用，而且也可以针对多个基因或基因族的共有序列来抑制多个基因表达的研究结果表明其有可能成为具广泛应用前景的抗肿瘤的基因治疗方法^[7]。这一可与人类基因组计划（human genomics program，HGP）相提并论的突破性研究进展开创了人类肿瘤基因治疗的新天地，为肿瘤治疗提供了新线索、新思路和新方法^[8]。研究以pGenesil-1载体为骨架，构建了带增强型绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein，EGFP ）报告基因的、靶向bcl-2基因的shRNA表达载体；以高表达bcl-2 基因的HepG-2细胞为靶细胞，探索了靶向bcl-2的shRNA表达载体抑制该细胞bcl-2表达的、诱导该细胞凋亡和生长抑制的作用，为利用RNAi技术治疗临床肿瘤提供了理论基础和实验依据。

1资料与方法

1.1 主要试剂

携带EGFP基因的pGenesil-1（武汉晶赛生物技术公司）、小量质粒提取试剂盒（上海华舜生物有限公司），T4DNA连接酶、限制性内切酶等（MBI公司）、转染试剂lipofectamine 2000（invitrogen）、鼠抗人bcl-2单抗（Ancell Corporation）、HRP标记的羊抗鼠κ链（单抗）（Southern Biotechnology Associates, Inc）、细胞凋亡检测试剂盒（BioVision, Inc）等。

1.2 靶向bcl-2基因寡核苷酸的设计

根据shRNA设计原则和GenBank中的bcl-2编码序列，选择设计的三对靶向bcl-2基因的DNA序列 (分别命名为B1～B3) 和一对与任何人类基因序列均无同源性的DNA序列作为阴性对照序列（命名为S），在其两端添加BglⅡ和HindⅢ 酶切位点，用TTTTT作为转录终止子，并用BLAST软件进行同源性分析。各对siRNA序列如下：

B1：正义链：5′-GAT CTG CTG CAC CTG ACG CCC TTC TTC AAG AGA GAA GGG CGT CAG GTG CAG CTT TTT-3′、反义链5′-AGC TTA AAA AGC TGC ACC TGA CGC CCT TCT CTC TTG AAG AAG GGC GTC AGG TGC AGC-3′ ； B2：正义链：5′- GAT CTG AAG TAC ATC CAT TAT AAG TTC AAG AGA CTT ATA ATG GAT GTA CTT CTT TTT-3′、反义链：3′-AGC TTA AAA AGA AGT ACA TCC ATT ATA AGT CTC TTG AAC TTA TAA TGG ATG TAC TTC-3′;B3：正义链3′-GAT CTG GGA GAT AGT GAT GAA GTA TTC AAG AGA TAC TTCATC ACT ATC TCC CTT TTT-3′、反义链5′-AGC TTA AAA AGG GAG ATA GTG ATG AAG TAT CTC TTG AAT ACT TCA TCA CTA TCT CCC-3′;阴性对照序列S：正义链：序列为5′-GAT CTC CTT AGA GTC TCC TGA GCT TCA AGA GAG CTC AGG AGA CTC TAA GGC TTTTT-3′、反义链：3′-AGC TTA AAA GCC TTA GAG TCT CCT GAG CTC TCT TGA AGC TCA GGA GAC TCT AAG GC-3′。

1.3 bcl-2 shRNA表达载体的构建

将上述合成的寡核苷酸分别溶解于100μl无菌双蒸水中，取相应的正反义链各5μl,加入含5μl 100mmolNacl的EP管中，混匀，于94℃水浴 5min后，待其自然冷却，使编码shRNA 的两条寡脱氧核糖核酸退火；用T4 DNA连接酶将已复性的各对DNA序列分别插入用BamH I和Hind Ⅲ双酶切的pGenesil-1质粒中，连接产物转化感受态DH5a。从转化的DH5a中提取重组质粒，用BglⅡ和Hind Ⅲ 酶切重组质粒、 1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，最后将经酶切和电泳分析确认的阳性重组质粒送上海基康生物工程有限公司进行DNA序列测定。经上述方法鉴定确认的靶向bcl-2基因的三个阳性重组质粒被依次命名为pGenesil-B1～B3; 阴性对照重组质粒被命名为pGenesil-S。

1.4 HepG-2细胞的培养与传代

HepG-2细胞培养于10%新生牛血清(FCS)、100 u／mL青霉素、100ug／ml链霉素的RPMI1640完全培养液中，置37℃ 、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，2～3d传代1次。所有实验均选用对数生长期细胞。

1.5.1

转染前取对数生长期细胞1000 r／min，离心5 min，用无抗生素培养液重悬，调整细胞数为5×10⁵个／mL，加入6孔培养板中（每孔2 mL）。分为6组进行实验：pGenesil-B 1组， pGenesil-B2组， pGenesil-B1组,阴性

对照shRNAS组、空载体组、空白组，每组设3个平行孔，按Lipofectasece 2000转染试剂盒（Invitrogen公司）说明转染各组细胞；置37℃培养，4～6 h后加入含血清和抗菌素的RPMI1640培养液，继续培养，24h后收集转染细胞提取总RNA进行半定量分析mRNA，具体实验如下。

1.5.2

遵循PCR引物设计原则，根据人bcl-2基因和β-actin cDNA序列，设计并由上海生物工程公司合成扩增上述两基因的引物，其序列为：bcl-2基因上游引物：5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′、下游引物：5′-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3′；内参ß-actin的引物为:P1 5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′P2：5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′；按TRIZOL试剂盒说明，提取上诉各组细胞的总RNA。逆转录cDNA。再用bcl-2引物和β-actin引物进行分管PCR扩增。取PCR产物上样于1.5%的琼脂糖凝聚电泳分离，采用BIO-RAD的Qantity One软件进行图象扫描分析，以bcl-2与β-actin的灰度比值A作为比较指标，抑制率=( A对照组-A实验组)/ A对照组ⅹ100%。

1．7 免疫细胞化学法检测bc1-2蛋白

各组HepG-2细胞以5×10⁵ /孔 接种于6孔板，按上述方法转染后继续培养72 h，弃掉上清。用4%的多聚甲醛室温固定30min，弃去多聚甲醛，用免疫细胞化学SP法检测，Bcl-2抗体为小鼠抗人bcl-2(1：100)，二抗为HRP标记的羊抗鼠κ链（单抗）（Southern Biotechnology Associates, Inc）、DAB显色，避光放置大约10分钟后置显微镜下观察。每一批实验均以PBS代替一抗作为空白对照。

1．8细胞增殖检测

1.8.1

如上分为6组进行实验，每组设3个平行孔，在96孔培养板中每孔种4.0×10⁴ 个细胞，按上述方法转染后继续培养24、48、72和96 h加入MTT100µg，继续培养4 h，弃上清，每孔加入200µl（二甲亚砜）DM-SO，用酶标仪检测吸光度OD值，按以下公式计算：

抑制率=(空白对照组A均值一实验组A均值)/空白对照组A均值×100％

细胞存活率= 实验组A均值／空白对照组A均值×100％。

1.8.2

应用细胞凋亡检测试剂盒（BioVision, Inc）FITC／PI法检测细胞凋亡，如上分为6组进行实验：每组设3个平行孔，在6孔培养板中每孔种5×10⁵个细胞，按上述方法转染后继续培养48h、收集上述3组细胞，按检测试剂盒说明处理细胞后，取1×10⁶个细胞上流式细胞仪进行检测。实验数据用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。

2 结果

2．1 重组质粒酶切及DNA测序鉴定

在重组质粒中，经BglⅡ酶切后，pGenesil-B1、pGenesil-B2、pGenesil-B3与空载体比较无变化。经HindⅢ酶切后，与空载体质粒电泳图谱相同，均被切开(图1)。重组的RNAi载体pGenesil-B1、pGenesil-B2、pGenesil-B3和对照pGenesil-S经测序，均与设计合成的反向链完全一致，说明已把合成的寡核苷酸插入到了RNAi载体中。

图1 pGenesil-B 的限制性内切酶消化结果

Lane1: DNA maker；Lane2: pGenesil-B1；

Lane3: pGenesil-B digsted with BglⅡ；

Lane4: pGenesil-B digsted with HindⅢ；

Lane5: pGenesil-B digsted with BamHⅠ；

Lane6: pGenesil-B digsted with BamHⅠ/BglⅡ；

lane7: pGenesil-B digsted with HindⅢ/BglⅡ；

lane8: pGenesil-B digsted with HindⅢ/ BamHⅠ

2．2 各种shRNA表达载体在HepG-2细胞中的转染效率及表达水平

转染24 h和48 h后在倒置荧光显微镜下观察HepG-2细胞，可见pGenesil-B和对照pGenesil-S、空载体组均有较多细胞表达绿色荧光，未转染组细胞未见绿色荧光(结果未显示)。流式细胞仪检测发现，pGenesil-B和对照pGenesil-S、空载体组EGFP阳性细胞百分率分别为58.15％、52.57 和56.62％，转染组间差异均无统计学意义，P>0 05。

2．3 RT-PCR检测各组细胞中bcl-2 mRNA转录情况

RT-PCR对转染不同的shRNA表达载体的HepG-2细胞中bcl-2 mRNA转录水平的检测结果表明除pGenesil-B2对bcl-2 mRNA转录有较强抑制作用外，其它靶向bcl-2的shRNA均未呈现明显的抑制作用（见图2和表1）

图2 半定量PCR检测细胞内bcl-2 mRNA的转录结果

Fig2 semi-quantity of bcl-2 mRNA by PCR

Lane1: DNA marker；Lane 2: contrast

Lane3: pGenesil-1

Lane 4: pGenesil-B1;Lane5: pGenesil-B 2

Lane 6: pGenesil-B 3

Lane7: pGenesil-S

表1 靶向bcl-2的shRNA转染后的hepG-2细胞内bcl-2 mRNA的抑制率

Table1 The inhibition ratio on bcl-2 mRNA of the HepG-2 cell transfected and untransfected pGenesil-B

2．4 bcl-2 shRNA对HepG-2细胞bcl-2蛋白表达的影响

bcl-2蛋白分布于细胞质，胞质内棕黄色颗粒超过1／4记为阳性细胞，统计500个HepG-2细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。pGenesil-B1、pGenesil-B2、pGenesil-B3和对照pGenesil-S分别作用于HepG-2细胞72 h bcl-2蛋白表达阳性细胞百分比分别为15.21±2.32、9.51±2．51、14.15±2．67、36.83±3.35；未处理HepG-2细胞bcl-2表达量为38.15±3.46。单因素方差分析显示，pGenesil-B1、pGenesil-B2、pGenesil-B3分别作用于HepG-2细胞bcl-2蛋白表达量分别与对照pGenesil-S作用组、未处理hepG-2细胞组相比差异有统计学意义，P<0．05，且pGenesil-B2比其它两种抑制bcl-2蛋白表达更为明显。对照pGenesil-S作用于HepG-2细胞bcl-2蛋白表达量与未处理HepG-2细胞组相比差异无统计学意义，P>0．05。

2.5转染bcl-2 shRNA对HepG-2细胞生长的影响

2.5.1

pGenesil-B作用于HepG-2细胞48、72和96 h，明显抑制细胞的生长，分别与阴性对照pGenesil-S组、空载体组和未处理组相比，差异有统计学意义，P<O．01，pGenesil-B2效果更为显著（表2）。

表2 HepG-2细胞转染靶向bcl-2的shRNA后的细胞抑制率

2.5.1

表3流式细胞仪检测转染靶向bcl-2的shRNA后HepG-2细胞调亡率（％）

Table3  Apoptosised rate of the HepG-2 cell transfected and untransfected pGenesil-B

图3-1                            图3-2

图3-3                              图3-4

图3流式细胞仪检测调亡细胞

Fig3 To detect Apoptosised cells by flow cytometer

Fig3-1: contrast; Fig3-2: pGenesli-B1; Fig3-3: pGenesli-B3; Fig3-4: pGenesli-B2

3 讨论

肿瘤是一种具有癌基因活化和肿瘤抑制基因灭活，凋亡调控基因异常特征的基因功能异常性疾病。大量研究表明细胞凋亡调控基因异常、特别是凋亡抑制基因过度表达，致细胞存活时间延长和永生化，可能是肿瘤发生发展的首要而关键的步骤和重要原因^[9]。肿瘤细胞所表现的这些特征不仅限制了肿瘤常规治疗方法的疗效，而且提示抗细胞凋亡基因有可能成为临床肿瘤治疗的重要靶分子^[10,11]。以编码细胞凋亡抑制蛋白bcl-2的基因为靶基因、高表达bcl-2蛋白的HepG-2肝癌细胞系为靶细胞，采用RNAi技术探索了靶向bcl-2基因的shRNA表达载体抑制bcl-2蛋白表达，诱导HepG-2细胞凋亡和抑制该细胞增殖的作用，从所获研究结果中得到以下启示。

3.2.1

将化学合成的、靶向bcl-2基因不同部位的三对DNA序列克隆到含U6启动子和EGFP的质粒pGenesil-1载体中、所构建的shRNA具以下特点①可方便通过绿色荧光蛋白的表达水平确定shRNA的转染效率，以便客观评价试验结果。②shRNA表达载体插入位点选用BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点，在待插入的DNA序列两端添加BglⅡ和HindⅢ，由于BamHⅠ与BglⅡ是同尾酶，故插入片段可以与用BamHⅠ和HindⅢ双酶切的载体连接，但连接以后BamHⅠ位和BglⅡ酶切位点消失、皆不能使重组载体线性化，仅HindⅢ可以线性化重组载体。因此可利用这一特点来简单方便地鉴定重组载体。

3.2.2

转染pGenesil-B2的HepG-2细胞的bcl-2蛋白表达下调、细胞增殖受到明现抑制、大量细胞发生凋亡，与空白对照和无关阴性对照比较有显著差异（P＜0.05）。这些研究结果与Holle等的报道一致^[12]。

siRNA抑制靶基因表达的有效性，在很大程度上取决于其靶向的mRNA部位及与靶mRNA序列的匹配程度的结论，无疑亦提示siRNA靶位点的选择是靶向抑制基因表达成败的关键^[13,14]。因靶向的mRNA部位及其与靶mRNA序列匹配程度不适当，而导致siRNA不能有效抑制靶基因表达的现象，称为siRNA的靶向偏离作用（off-target effects）^[15,16]，克服siRNA的靶向偏离作用是今后将siRNA用作治疗制剂必须面临的严峻挑战。

综上所述表明本研究不仅为抑制bcl-2复制的实验与应用研究提供了理论与实验依据，为进一步进行有关研究提供了一定的物质基础，而且还将为抑制其它癌基因复制的研究提供可借鉴的技术路线、实验方法和物质基础，因此具较大的理论意义，实用价值和良好的应用前景。因此对RNAi的深入研究，无疑将大大推进基因功能的研究，而且将有可能为各种病毒性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和其它遗传异常相关疾病的根治开辟新的途径^[17]。siRNA与RNAi的研究与应用，具有极其重要的理论和实际意义可以预见在此领域的研究成果将对生物学和医学的发展产生深远的影响^[18,19]。

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